产品目录

本试剂盒适用于从各种原代或传代细胞中分步提取膜蛋白/胞浆蛋白/核蛋白，含有的独特配方能够有效溶解细胞膜组分，包括细胞质膜、核膜和各种细胞器膜。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用百奥莱博其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用蛋白脱盐柱脱盐处理。

• 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 将蛋白提取的时间缩短至1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，试剂拆封后请尽快使用完！

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

• 提取液制备：
  每400μL冷的蛋白提取液A/B/D中都分别加入2μL蛋白酶抑制剂混合物和2μL磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  
  • 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    
  • 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    
  • 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
• 取5～10×10⁶个细胞，在4℃，800×g条件下离心5～10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干。
  
  • 贴壁培养细胞用细胞刮刀收集细胞或胰酶消化下来均可。
• 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  
• 每5×10⁶个细胞中加入400μL冷的蛋白提取液A，混匀后，在4℃条件下用试剂盒所配针筒反复吸吹细胞，使细胞完全破裂。
  
  • 一般反复抽吸至轻微起泡即可。
    
  • 可以使用其它针筒，但是必须使用试剂盒所配的针头处理细胞。
    
  • 可以吸取少量液体进行镜检。
• 在4℃，1000×g条件下离心5分钟。
  
• 将上清（I）吸入另一干净离心管，在沉淀中加入100～200μL冷的提取液B，高速涡旋振荡15秒，充分混匀。
  
  • 上清（I）置4℃保存备用。
• 将混匀的提取液B置4℃低速振荡30～40分钟。
  
  • 使用较低转速保持提取液稍微晃动即可。
    
  • 没有振荡条件可以不振荡，置2～8℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
• 在4℃，12000×g条件下离心10分钟。将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
  
• 在步骤6中所得到的上清（I）中加入8μL提取液C，充分混匀。
  
  • 添加提取液C时注意有效的加入，由于提取液C比较粘稠，可能会吸附在吸头，没有添加进去，气温较低时可以把吸头和提取液C在37℃预热一下。
    
  • 添加时不要将吸头伸入到冷的提取液A中，会导致提取液C凝固而出不来，在接近液面的地方沿着离心管壁加入，注意观察是否有效加入。
    
  • 加入后充分混匀。
    
  • 上清（I）须一直置4℃条件。
• 在2～8℃振荡20～30分钟。
  
  • 此步骤必须在2～8℃条件。
    
  • 使用较低转速保持提取液稍微晃动即可。
    
  • 没有振荡条件可以不振荡，置2～8℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
• 在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃下1000g离心3分钟，此时溶液分为两层，上层是胞浆蛋白部分，下层部分（II）是膜蛋白约为40～50μL。
  
  • 此步骤必须在37℃条件下离心。
    
  • 没有37℃离心条件也可以不离心，稍微延长37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。
• 将上层小心吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白。
  
• 用50～100μL冰冷的提取液D溶解步骤12中的下层部分（II），即得膜蛋白。
  
  • 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置至溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
    
  • 于4℃静置直至管底透明胶状物完全溶解。
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  
  • 建议用BCA法进行蛋白定量，推荐BCA法蛋白定量试剂盒
    
  • 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  
  • 处理部分样本时可能没有裂解完全，导致核蛋白/膜蛋白浓度低。只要适当延长提取液B、C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
    
  • 膜蛋白丰度较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大细胞的上样量。
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为提取液A中含有干扰Bradford法的组分，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取时出现胶状沉淀？
  核蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，不必进行超声处理。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组分，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
  
• 膜蛋白电泳没有条带？
  
  • 膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。
    
  • 膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超声处理一下，再进行蛋白定量。
    
  • 蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
    
  • 蛋白Loading buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%～10%。
    
  • 有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
    
  • 电泳时最好采用低电压低电流电泳。
    
  • 膜蛋白丰度通常较低，有条件可以尝试用银染染色。